RNA修飾在生命過程和疾病發生發展中的作用逐漸受到重視，其中5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾是熱門研究領域。本文聚焦于m5C 甲基轉移酶NSUN2在肝癌中的作用，NSUN2通過M5C修飾穩定PKM2 mRNA促進肝癌糖酵解和進展。

m5C修飾是指在RNA分子中，通過特定的酶將胞嘧啶（C）的第5位碳原子上加上一個甲基基團，形成5-甲基胞嘧啶。這種修飾不會改變RNA的基本核苷酸序列，但會在不改變遺傳信息編碼的基礎上，賦予RNA新的化學和生物學特性。m5C修飾主要由NSUN（NOL1/NOP2/SUN）家族的甲基轉移酶催化完成，涉及mRNA穩定性與翻譯調控、tRNA 穩定性與解碼功能、rRNA加工與核糖體功能和非編碼RNA功能調節，廣泛地參與到各種生命活動的調控中。

研究背景：

肝癌（HCC）是常見癌癥及癌癥死亡主要原因，術后轉移復發致患者5年生存率低。RNA 的5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾在多種癌癥中發揮作用，NSUN2是m5C甲基轉移酶，但它在肝癌中的臨床意義、作用機制等尚不明確。

研究方法：

臨床樣本采集與分組：收集125對肝癌（HCC）及相應癌旁組織（ANL），用于RT-qPCR、western blot及IHC分析NSUN2表達分布與患者臨床特征的相關性，并進行mRNA m5C斑點印跡和m5C-RIP-seq測序。

細胞實驗：主要檢測多株肝癌細胞株的及增殖、遷移和侵襲等細胞行為學改變。

動物實驗：選用5周齡雄性BALB/c裸鼠，在其雙側腋窩皮下接種HCC細胞建立皮下異種移植模型，定期測量腫瘤體積；通過尾靜脈注射HCC細胞建立肺轉移模型，用活體成像系統監測轉移過程。

其他：RNA免疫沉淀實驗、熒光素酶報告基因實驗、放線菌素D實驗、代謝測量實驗等；

主要研究結果：

（1）NSUN2在HCC組織中的表達上調；

通過對125對HCC和癌旁組織（ANL）的研究，運用蛋白質免疫印跡（WB）和免疫組化（IHC）分析，結果顯示HCC組織中NSUN2的蛋白水平顯著高于ANL組織。Kaplan-Meier 生存分析，結果顯示NSUN2高表達患者的總生存期（OS）和無復發生存期（RFS）明顯低于NSUN2低表達患者。此外，對80例HCC患者的臨床病理特征與NSUN2表達進行分析，發現NSUN2高表達與腫瘤大小、微血管侵犯（MVI）、TNM分期和BCLC分期顯著相關。腫瘤越大、存在微血管侵犯、TNM分期和BCLC分期越晚，NSUN2的表達越高。

圖1. HCC組織中NSUN2高表達并與HCC不良預后有關。

（2）體內外實驗檢測NSUN2 對HCC生長和轉移的影響

運用慢病毒分別在HepG2和SNU387細胞中穩定過表達NSUN2，在Hep3B和Huh7細胞中穩定沉默NSUN2。過表達NSUN2能夠促進肝癌細胞增殖和遷移，而沉默NSUN2則抑制肝癌細胞增殖和遷移。體內實驗結果表明，NSUN2過表達顯著促進了裸鼠皮下瘤生長并增加肝癌肺轉移，而NSUN2沉默則抑制皮下瘤生長和肺轉移。

圖2. NSUN2在體內外誘導肝癌的生長和轉移。

（3）NSUN2介導的m5C修飾在肝癌HCC中的作用

對5對HCC和癌旁正常肝組織進行m5C dot blotting，結果顯示HCC組織中總mRNA m5C 水平高于ANL組織；m5C-RIP-seq分析顯示HCC和癌旁正常肝組織m5C修飾存在差異，聯合分析mRNA m5C-RIP-seq和 mRNA-Seq數據，發現HCC中mRNA表達與m5C水平呈輕度正相關；KEGG通路分析顯示，表達和m5C水平均上調的mRNA主要富集在10條信號通路中，其中癌癥中的中心碳代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝等與代謝相關。

圖3. NSUN2介導的m5C高甲基化促進肝細胞癌的代謝轉變。

（4）PKM2是NSUN2介導的m5C修飾的主要靶標

對Hep3B-NSUN2-sh2細胞及其陰性對照進行mRNA測序，結果顯示敲低NSUN2后，236個基因上調，376個基因下調。將HCC中表達上調的mRNA、m5C 水平上調的mRNA以及 Hep3B細胞中敲低NSUN2后表達下調的mRNA進行重疊分析，通過維恩圖篩選出11個符合標準的mRNA（B3GNT3、CD7、EML2、FOXC1、GDF15、LRP4、MAPT、MCTP1、PKM2、PODXL 和 SLC1A7）。檢測這11個mRNA在40對HCC和癌旁正常肝組織中的表達，發現其中7個在HCC中上調。進一步檢測這7個mRNA在肝癌細胞系中的表達，結果顯示，在HepG2和SNU387細胞中過表達NSUN2后，只有PKM2的表達上調；在Hep3B 和Huh7細胞中沉默NSUN2后，PKM2的表達下調。此外，根據m5C-RIP-seq結果，PKM2 mRNA上調的m5C峰位于其3′ - UTR（chr15:72491753 - 72491855，hg19）。通過針對該峰的m5C-RIP-qPCR驗證了這一結果，進一步表明PKM2 mRNA是NSUN2作用的主要靶標。

圖4. PKM2 mRNA是NSUN2作用的靶標。

（5）NSUN2通過增加m5C水平穩定PKM2 mRNA

通過放線菌素D處理HCC細胞，并在不同時間點利用RT-qPCR分析PKM2 mRNA水平。結果顯示，過表達NSUN2會減緩PKM2 mRNA的降解，而沉默NSUN2則加速其降解。m5C-RIP-qPCR發現SNU387細胞中過表達NSUN2后，PKM2 mRNA m5C水平升高；在 Hep3B細胞中沉默NSUN2后，其m5C水平降低；隨后，使用針對PKM2的m5C峰的引物和經亞硫酸氫鹽轉化RNA逆轉錄的cDNA模板進行亞硫酸氫鹽PCR，然后進行Sanger測序，發現在chr15:72491773（hg19）位點（C773）的信號中，既有胞嘧啶（‘C’）又有胸腺嘧啶（‘T’），這表明該位點在HCC組織和細胞系中均發生了m5C 甲基化。通過計算各樣本中C773位點的m5C水平，發現HCC組織中的m5C水平高于癌旁正常肝組織。同時，SNU387細胞過表達 NSUN2后該位點m5C水平上升，Hep3B細胞沉默NSUN2后該位點m5C水平則下降。最后，構建含有野生型3′-UTR的PKM2 mRNA（PKM2-WT）和突變型 C773（PKM2-Mut）的質粒進行熒光素酶報告基因實驗。結果表明，過表達NSUN2可增加 PKM2-WT的熒光素酶活性，對PKM2-Mut則無此作用；沉默NSUN2的效果則相反表明 NSUN2 對PKM2的調控作用依賴于m5C位點C773。

圖5. NSUN2通過增加m5C水平穩定PKM2 mRNA。

（6）NSUN2通過上調PKM2促進HCC的糖酵解和進展

通過檢測過表達和敲低NSUN2后HCC細胞的葡萄糖攝取、乳酸生成、細胞外酸化率（ECAR）和糖酵解質子外流率（glycoPER）來評估糖代謝變化。發現過表達NSUN2顯著增加了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，敲低NSUN2則降低了這些指標，表明 NSUN2 促進HCC細胞的糖酵解。

圖6. NSUN2通過上調PKM2促進HCC的糖酵解和進展。

隨后，使用siRNA靶向PKM2，發現其可下調PKM2四聚體、二聚體和單體的表達，而過表達NSUN2可減緩這種下調作用。敲低PKM2抑制了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，而過表達NSUN2可部分阻斷這些抑制作用，表明NSUN2 對HCC糖酵解的促進作用部分通過上調PKM2實現。最后，檢測了PKM2對HCC細胞生長和侵襲的影響及NSUN2的作用，發現敲低PKM2抑制了HCC細胞的生長和侵襲，而過表達NSUN2可阻斷這種抑制作用，說明NSUN2通過上調PKM2促進HCC細胞的生長和侵襲。

（7）研究示意圖

直觀地展示從NSUN2表達上調，到PKM2 mRNA穩定、PKM2蛋白增加，再到促進HCC糖酵解、細胞增殖和遷移的一系列過程，為理解HCC的發病機制提供了重要的理論依據，也為后續研究潛在的治療靶點提供了方向。

圖7. NSUN2介導PKM2在HCC中的m5C調節機制示意圖。

研究總結：

肝癌中NSUN2表達上調且與預后不良相關；NSUN2通過增加PKM2 mRNA的m5C修飾穩定其表達，促進糖酵解，進而推動肝癌進展，研究明確PKM2是NSUN2介導m5C修飾的靶基因，揭示NSUN2促進肝癌進展的關鍵機制。綜合多種實驗方法，從細胞、動物模型及臨床樣本驗證，NSUN2可作肝癌預后指標和治療靶點，為肝癌臨床診療提供新思路。

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參考文獻

Qi Q, Zhong R, Huang Y, Tang Y, Zhang XW, Liu C, Gao CF, Zhou L, Yu J, Wu LY. The RNA M5C methyltransferase NSUN2 promotes progression of hepatocellular carcinoma by enhancing PKM2-mediated glycolysis. Cell Death Dis. 2025 Feb 9;16(1):82. doi: 10.1038/s41419-025-07414-5. PMID: 39924557; PMCID: PMC11808121.